1、什么是電泳?
電泳是一種利用電流根據DNA、RNA或蛋白質(zhì)的物理特性(如大小和電荷)來(lái)分離它們的技術(shù)。
2、什么是瓊脂糖凝膠電泳?
瓊脂糖凝膠電泳是一種電泳形式,用于根據核酸(DNA或RNA)片段的大小進(jìn)行分離。當施加電流時(shí),帶負電的DNA/RNA通過(guò)瓊脂糖凝膠的孔隙向凝膠帶正電的一端遷移,較小的片段遷移較快。由此產(chǎn)生的條帶可以用紫外線(xiàn)(UV)光來(lái)觀(guān)察。
然而,RNA往往會(huì )形成二級結構,而且有時(shí)同一個(gè)片段會(huì )有多個(gè)不同的種類(lèi),這會(huì )影響其遷移的方式。因此,觀(guān)察到的條帶并不總是代表它們的真實(shí)尺寸,圖像也很模糊。
在這種情況下,瓊脂糖天然凝膠(條件不會(huì )破壞分析物的自然結構)往往不用于分析RNA的大小,盡管它們可以提供數量和完整性的估計。替代方法包括RNA印跡法和變性瓊脂糖凝膠電泳,它們使用的條件能夠破壞二級結構。
瓊脂糖凝膠也可用于根據蛋白質(zhì)的大小和電荷來(lái)分離蛋白質(zhì)(與DNA/RNA不同,蛋白質(zhì)電荷根據所含氨基酸的不同而不同)。然而,由于瓊脂糖凝膠的孔徑較大,蛋白質(zhì)通常在聚丙烯酰胺凝膠上分離,而聚丙烯酰胺凝膠的孔徑較小,為小的蛋白質(zhì)分子提供更大的分辨率。
因此,在本文的剩余部分,我們將重點(diǎn)討論DNA瓊脂糖凝膠電泳。
3、凝膠電泳是如何工作的?
瓊脂糖是瓊脂的一種成分,它形成了一個(gè)由螺旋狀的瓊脂糖分子組成的三維凝膠基質(zhì),這些螺旋狀的瓊脂糖分子在超線(xiàn)圈束中被氫鍵固定,有通道和孔隙,分子能夠通過(guò)。當加熱時(shí),這些氫鍵斷裂,使瓊脂糖變成液體,并允許它在復位前被倒入模具。
瓊脂糖在凝膠中的百分比影響了孔的大小,從而影響了可能通過(guò)的分子的大小以及通過(guò)的速度。瓊脂糖的百分比越高,孔徑越小,因此能夠通過(guò)的分子越小,遷移速度越慢。
在分子生物學(xué)實(shí)驗室中,0.7~1%的瓊脂糖凝膠通常用于日常的DNA分離,對0.2~10kb范圍內的片段提供良好、清晰的區分。較大的片段可以用較低百分比的凝膠來(lái)解決,但它們會(huì )變得非常脆弱且難以處理,而較高百分比的凝膠會(huì )對小片段提供更好的分辨率,但很脆且可能凝固不均勻。
由于DNA在肉眼中是不可見(jiàn)的,在凝固過(guò)程中,一種夾層染料如溴化乙錠(EtBr)被納入凝膠中。這與DNA結合,并在紫外線(xiàn)下發(fā)出熒光,從而使DNA片段可以被觀(guān)察到。存在的DNA越多,條帶就越亮。
與加載染料混合的樣本被放置在凝膠的一端,凝膠被浸泡在運行緩沖液中。然后電流通過(guò)凝膠槽兩端的電極穿過(guò)凝膠。
當樣品運行得足夠遠以獲得足夠的分離時(shí),將凝膠從槽中取出并放在一個(gè)紫外光箱上。然后,夾層染料可以使樣品條帶可視化,并通過(guò)與已知條帶大小的DNA marker進(jìn)行比較來(lái)確定其大小。遷移距離和片段大小之間的關(guān)系是非線(xiàn)性的,增加了包括尺寸標記作為指導的重要性。
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